골다공증은 점진적인 골량 감소 및 골 미세구조의 손상으로 특징되는 대사성 골 질환이다. 특히, 폐경기성 골다공증은 폐경 후 중년 여성에게서 흔히 발생된다. 이 연구의 목적은 난소절제 쥐를 대상으로 12주간의 복합운동이 골밀도, 골대사 지표 및 OPG/RANKL mRNA 발현에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.
총 40마리 SD계열 암컷 쥐를 통제군(CON, n=10), 난소절제군(OVX, n=10), 난소절제-저항성 운동군(OVX-REX, n=10), 난소절제-복합운동군(OVX-ARE, n=10)으로 무선배정 하였다. 복합운동은 트레드밀 운동과 사다리 등반 운동을 격일제로 12주 동안 주 4회 실시하였다.
난소절제군과 비교하여 모든 운동 처치군의 골밀도 및 골강도는 유의하게 높은 것으로 나타났다(
이상의 결과를 종합해 볼 때, 복합운동은 폐경기성 골다공증의 지연 및 예방을 위한 더 효율적인 운동 중재 전략으로 판단된다.
Osteoporosis is a systemic metabolic bone disease characterized by gradual decrease of bone mass and damage of the bone microstructure. In particular, postmenopausal osteoporosis is the most common type in women after menopause. This study aims to investigate the effects of combined exercise training on bone mineral density (BMD) and OPG/RANKL mRNA levels in ovariectomized rats.
A total of 40 Sprague-Dawley female rats were randomly divided into four groups: (1) CON (sham-operation, n=10), (2) OVX (ovariectomy, n=10), (3) OVX-REX (ovariectomy-resistance exercise, n=10), and (4) OVX-ARE (ovariectomy-combined aerobic and resistance exercise, n=10). Combined exercise training was performed on a treadmill and ladder adapted to rats in alternate days (4 days/wk, for 12 wk).
Compared to the OVX group, all exercise treatments increased BMD and bone breaking force(
These results suggest that combined exercise may be a more effective therapeutic strategy to prevent and delay postmenopausal osteoporosis than resistance-only training.
폐경기 여성은 호르몬 불균형, 칼슘 결핍 및 체내 산화 스트레스 증가로 인해 비만, 관상동맥 질환, 알츠하이머, 골다공증 등과 같은 다양한 질병에 노출된다(
정상적인 상태에서 뼈 구조는 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수와 조골 세포(osteoblast)에 의한 골 형성의 반복적인 remodeling 과정을 거치게 되고, 이는 건강한 뼈 유지와 각종 면역세포의 발달 및 성숙에 중요한 골수 구조를 형성한다(
반면, 에스트로겐 감소 및 결핍은 조골세포와 파골세포 항상성에 부정적 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 골 형성 감소 및 골 흡수 증가에 따른 단위용적 내 골량(bone mass)이 감소하게 된다(
폐경기성 골다공증의 발생은 파골세포의 분화와 직접적으로 연관되며(
이와 더불어, osteocalcin (OC), C-terminal telopeptide of collagen type 1 (CTx-1) 등은 골 대사(bone metabolism)에 관여하는 주요 요인으로 제안된다. OC는 조골세포(osteoblast)로 부터 합성되는데 폐경기 및 청소년기와 같이 골전환(bone turnover)이 증가된 시기에 높은 수준을 보이는 것으로 알려진 반면에(
흔히 폐경과 관련된 대사적 변화에 대한 호르몬 치료 요법이 널리 이용되고 있으며, 그 효과성 역시 선행연구를 통해 입증되고 있다. 하지만, 이러한 약리적 요법의 효과성에도 불구하고
반면, 신체활동은 골다공증 관리를 위한 비약리적 접근으로써, 뼈 건강 유지를 위한 중요한 매개체로 제안된다. 폐경기 중년 여성의 골밀도 및 골 대사 관련 인자의 조절장애(dysregulation)에 대한 규칙적인 운동 및 과거 지속적인 운동 참여 경험의 긍정적 효과는 여러 선행연구를 통해 입증되었다(
따라서 본 연구에서는 단일 형태의 운동과 비교하여 12주간의 규칙적인 복합운동 중재가 폐경모델 난소 절제 쥐의 골밀도, 골대사 지표 및 OPG 및 RANKL mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다.
실험동물은 Nara Biotech.(Seoul, Korea)에서 공급받은 Sprague-Dawley (SD) 계열 20주령 암컷 흰쥐 40마리를 대상으로 하였다. 실험동물은 사육케이지(42 × 28 cm)를 이용해 실험실 온도 22~24℃, 습도 60±5%가 유지되며, 밤낮주기(12시간 light/ 12시간 dark)가 자동 조절 장치에 의해 조절되는 사육실에서 1주간 예비 사육 후 난소 절제 시술을 시행하여 대조군(CON, n=10), 난소절제 대조군(OVX, n=10), 난소절제군-저항성 운동군(OVX-REX, n=10), 난소절제군-복합운동군(OVX-ARE, n=10)으로 나누어 12주간 실험을 실시하였다. 식이는 실험기간 동안 고형사료(단백질 22.5%, 지방 3.5%, 저섬유 7.5%, 회분 9.0%, 칼슘 0.7%, 인 0.5%)와 물을 충분히 섭취하도록 하였으며, 동물실험 윤리위원회의 승인(HNU 2018-1)을 받아 실험을 수행하였다.
난소절제 시술은
복합운동 프로그램은
12주간의 실험 종료 후 적출한 대퇴골은 골격에 붙어있는 근육, 인대 및 지방을 제거하고 50℃에서 건조한 후 골밀도 및 골미네랄 함량을 방사선 골밀도 측정기(pDEXA X-ray bone densitometer, Norland Co., USA)를 사용하여 측정하였다. 해상도는 1.0×1.0 mm, 스피드는 20 mm/sec, 샘플의 길이는 1.60cm, 폭(너비)은 3.90cm로 설정하여 측정하였다. 골강도(breaking force)는 대퇴골에 하중이 걸렸을 때 부러지는 순간의 최대응력을 의미하며, 종합물성측정기(Rheo Meter CR-500DX, SUN SCIENTIFIC Co. Ltd., Japan)를 사용하여 측정하였다. 측정항목은 구부림 강도 측정, 진입 깊이는 5.0 mm, 인장/압축은 압축, 테이블(헤드)스피드는 60 mm/min, 로드셀 최대 응력은 10 kg, 샘플의 어댑터 거리는 0.0 mm, 아답터와 지지대의 간격은 10 mm로 설정하며, 샘플 타입은 원통형(눕힘), 길이와 높이 설정은 각 샘플의 해당되는 mm를 설정 조건으로 하여 측정하였다.
혈액 채취는 12주간 운동 중재 후 실험동물을 희생시키고, 심장으로부터 5ml의 혈액을 채혈하였다. 혈청 OC 측정은 one-step solid phase를 이용한 competitive radioimmun-assay에 기초한 Osteocalcin MYRIA kit (Technogenetics Srl, Milan, Italy)으로 radioimmunoassay를 한 후, gamma-counter를 이용하여 항원 항체 결합 정도를 측정하였다. 혈청 CTx-1 농도 측정은 Rat LapsTM (CTX-1) EIA kit (Immunodiagnostic Systems Ltd., Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 측정하였다.
Total RNA의 추출은 대퇴골에서 적출한 조직에 Trizol 500μl를 첨가한 후 syringe를 이용하여 세포를 균질화시키고 15~30℃에서 5분간 방치한 후 chloroform 100 μl을 첨가하여 부드럽게 inverted mix 한 후, 4℃에서 12000g로 15분간 원심분리한 후 상층액을 획득하였다. 상층액을 새 tube에 옮기고 동량의 isopropanol과 혼합하여 실온에서 10분간 침전시킨 후 12000g로 10분간 원심분리 하여 RNA pellet을 얻은 후 여기에 75% ethanol 500μl를 넣어 7500g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 상온에서 방치하여 RNA pellet을 완전히 건조시킨 후 Diethylpyrocarbonate (DECP) 용액으로 RNA pellet을 녹인다. 녹인 RNA는 분광광도계인 DU 530(Beckman instrument, CA, USA)를 이용하여 260nm에서 정량하였다.
역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 2 μg을 DNase I(10 U/μl) 2 U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 μl 10 mM dNTPs mix, 1 μl random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 μl), RNA inhibitor로써 1 μl RNase inhibitor (20 U/μl), 1 μl 100 mM DTT, 4.5 μl 5×RT buffer (250 mM Tris-HCL, pH 8.3, 375 mM KCL, 15 mM MgCL2)를 가한 후, 1 μl의 M-MLV RT (moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega, U.S.A.)에 200 U/μl를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종부피가 20 μl가 되도록 하였다. 이 20 μl의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37 ℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하고 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 cDNA를 합성하였다.
RT-PCR은 7500 Real-time PCR system을 이용하였다. OPG mRNA의 primer는 Forward: 5'-TGTGGAATAGATGTCACCCTGTGC-3’; Reverse: 5'-CACAGAGGTCAATGTCTTGGATGATC-3'이며, RANKL mRNA primer는 Forward: 5'-GCTTCTCAGGAGTTCCAGCTATGAT-3'; Reverse:5'-CGTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCT-3'을 이용하였으며, GAPAD의 primer는 Forward: 5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG3';Reverse: 5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'를 이용하였다. 반응 조건은 pre-denaturation은 2min at 50℃, 10min 94℃, 그리고 40 cycles을 0.15min at 95℃, 1min at 45℃에서 수행하였다.
본 연구의 자료 처리는 SPSS 21.0 프로그램을 이용하여 각 항목별 평균과 표준편차를 산출하였다. 측정변인들의 그룹 간 평균의 차이 검증은 일원분산분석(one-way analysis of variance; ANOVA)을 실시하였으며, 그룹 간 유의성이 나타날 경우 사후검증은 Duncan의 방법을 실시하였다. 이때 통계적 유의 수준은 .05로 설정하였다.
12주간의 복합운동 중재 후 대퇴골의 골밀도와 골강도는 <
12주간의 복합운동 중재 후 혈청 골대사 인자의 농도는 <
12주간의 복합운동 중재 후 OPG mRNA와 RANKL mRNA 발현을 분석한 결과는 <
에스트로겐 결핍에 따른 골 대사 항상성의 불균형은 골다공증 발생과 직접적으로 연관된다. 특히 골 대사 항상성의 장애로 발생되는 단위 면적 내 골량 감소는 미세한 충격에도 불구하고 쉽게 골절을 일으킬 수 있다. 일반적으로 난소절제술을 시행한 동물 모델은 골량 및 골강도가 낮을 뿐만 아니라 골대사의 전환이 더 빠르게 나타나며, 이러한 현상은 골다공증으로 고통받는 중년 여성들에서도 관찰된다(
본 연구에서는 폐경기성 골다공증 발생과 관련된 주요 요인에 대한 복합운동의 중재 효과를 규명하고자 하였다. 본 연구결과에서, 난소절제를 시행한 OVX 그룹은 대퇴골 골밀도, 골강도 및 혈청 OC 농도가 유의하게 감소된 반면 골 흡수 지표 CTx-1 농도는 유의하게 증가하였다. 또한, 골수 세포 내 OPG mRNA 발현이 유의하게 감소되었고, RANKL mRNA 발현은 증가되었다. 이와는 반대로 12주간의 규칙적인 운동 중재는 RANKL을 제외한 나머지 변인들의 개선에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.
운동 중 발생되는 기계적 힘(mechanical force)은 지면반력과 근 수축력 활성을 통해 골 조직의 전반적인 건강에 기여할 수 있다(
또한, 골다공증의 진행 및 병적 상태에서 골 형성 및 골 흡수 중 혈액으로 방출되는 OC 및 CTx-1의 농도 수준은 조골세포와 파골세포의 활성을 예측할 수 있는 주요 지표이다.
골 대사의 항상성은 조골세포 골 형성과 파골세포 골 흡수 사이의 균형에 의해 유지되며, 또한 OPG와 RANKL의 상대적 수준은 osteogenesis와 osteoclastogenesis 과정을 결정한다(
본 연구 결과를 종합해 볼 때, 골밀도 및 골대사 관련 요인의 개선을 위해서는 단일 형태의 운동보다는 적정한 운동 강도에 부합된 저항성 및 유산소 운동의 복합적 처치가 좀 더 효과적인 방법이라 판단된다. 또한 에스트로겐 결핍에 따른 골 대사 변화는 IL-1(interleukin-1, -6) 그리고 tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 같은 골 용해성 cytokine 분비에 지대한 영향을 받는다는(
이 논문은 2017년 대한민국 교육부와 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (NRF-2017S1A5A2A01023349)
Albertazzi, P. (2007). Non-estrogenic approaches for the treatment of climacteric symptoms.
Andreoli, A., Celi, M., Volpe, S. L., Sorge, R., & Tarantino, U. (2012). Long-term effect of exercise on bone mineral density and body composition in post-menopausal ex-elite athletes: a retrospective study.
Bundkirchen, K., Macke, C., Angrisani, N., Schäck, L. M., Noack, S., Fehr, M., Krettek, C., & Neunaber, C. (2018). Hemorrhagic shock alters fracture callus composition and activates the IL6 and RANKL/OPG pathway in mice.
Beck, T. J., Kohlmeier, L. A., Petit, M. A., Wu, G., Leboff, M. S., Cauley, J. A., Nicholas, S., & Chen, Z. (2011). Confounders in the association between exercise and femer bone in postmenopausal women.
Beederman, M., Farina, E. M., & Reid, R. R. (2014). Molecular basis of cranial suture biology and disease: Osteoblastic and osteoclastic perspectives.
Bergström, I., Parini, P., Gustafsson, S. A., Andersson, G., & Brinck J. (2012). Physical training increases osteoprotegerin in postmenopausal women.
Bolton, K. L., Egerton, T., Wark, J., Wee, E., Matthews, B., Kelly, A., Craven, R., Kantor, S., & Bennell, K. L. (2012). Effects of exercise on bone density and falls risk factors in post-menopausal women with osteopenia: a randomised controlled trial.
Eghbali-Fatourechi, G., Khosla, S., Sanyal, A., Boyle, W. J., Lacey, D. L., & Riggs, B. L. (2003). Role of RANK ligand in mediation increased bone resorption in early postmenopausal women.
Farr, J., Rowsey, J., Eckhardt, B., Thicke, B., Fraser, D., Tchkonia, T., Kirkland, J., Monroe, D., & Khosla, S. (2019). Independent roles of estrogen deficiency and cellular senescence in the pathogenesis of Osteoporosis: Evidence in young adult mice and older humans.
Gómez-Cabello, A., Ara, I., González-Agüero, A., Casajús, J. A., & Vicente-Rodríguez, G. (2012). Effects of training on bone mass in older adults: A systematic review.
Han, X., Gong, S., Li, N., Wang, X., Liu, P., Xu, Y., He, X., Jiang, W., & Si, S. (2019). A novel small molecule which increases Osteoprotegerin expression and protects against ovariectomy-related bone loss in rats.
Idris, A. I. (2012). Ovariectomy/orchidectomy in rodents.
Imtiaz, B., Taipale, H., Tanskanen, A., Tiihonen, M., Kivipelto, M., Heikkinen, A. M., Tiihonen, J., Soininen, H., Hartikainen, S., & Tolppanen, A. M. (2017). Risk of Alzheimer's disease among users of postmenopausal hormone therapy: A nationwide case-control study.
Iwamoto, J., Shimamura, C., Takeda, T., Abe, H., Ichimura, S., Sato, Y., & Toyama, Y. (2004). Effects of treadmill exercise on bone mass, bone metabolism, and calciotropic hormones in young growing rats.
Moreira, L. D., Oliveira, M. L., Lirani-Galvão, A. P., Marin-Mio, R. V., Santos, R. N., Lazaretti-Castro, M. (2014). Physical exercise and osteoporosis: effects of different types of exercises on bone and physical function of postmenopausal women.
Muir, J. M., Ye, C., Bhandari, M., Adachi, J. D., & Thabane, L. (2013). The effect of regular physical activity on bone mineral density in post-menopausal women aged 75 and over: a retrospective analysis from the Canadian multicentre osteoporosis study.
Jung, H. J., Lee, J. E., & Oh, J. K. (2007). Effects of WBV exercise on OPG, RANKL and BMD in ovariectomized rats.
Katsumata, T., Nakamura, T., Ohnishi, H., & Sakurama, T. (1995). Intermittent cyclical etidronate treatment maintains the mass, structure and the mechanical property of bone in ovariectomized rats.
Kido, K., Ato, S., Yokokawa, T., Sato, K., & Fujita, S. (2018). Resistance training recovers attenuated APPL1 expression and improves insulin-induced Akt signal activation in skeletal muscle of type 2 diabetic rats.
Kim, H. J., Yoon, H. J., Kim, S. Y., & Yoon, Y. R. (2014.) A mediumchain fatty acid, capric acid, inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation via the suppression of NF-κB signaling and blocks cytoskeletal organization and survival in mature osteoclasts.
Kim, C. S., Kim, H. J., Kim, J. Y., Kim, J. W., Park, D. H., Lim, S. T., & Min, S. K. (2017). The effects of exercise intensity difference on bone metabolism markers and cytokines of the RANKL/RANK/OPG system in korean osteopenia elderly women.
Kitareewan, W., Boonhong, J., Janchai, S., & Aksaranugraha, S. (2011). Effects of the treadmill walking exercise on the biochemical bone markers.
Lee, J. W., Kim, H. J., Jhee, O. H., Won, H. D., Yu, Y. J., Lee, M. H., Kim, T. H., Om, A. S., & Kang, J. S. (2005). Effects of alternative medicine extract on bone mineral density, bone strength and biochemical markers of bone metabolism is ovariectomized rats.
Lobersztajn, A., & Trémollières, F. (2012). Menopause and bone. Journal de Gynecologie, Obstetrique Biologie Reproduction,
Oh, T. W., Tanaka, S., Naka, T., & Igawa, S. (2016). Effects of high-intensity swimming training on the bones of ovariectomized rats.
Rector, R. S., Rogers, R., Ruebel, M., Widzer, M. O., & Hinton, P. S. (2009). Lean body mass and weight bearing activity in the prediction of bone mineral density in physically active men.
Rodrigues, B., Figueroa, D. M., Mostarda, C. T., Heeren, M. V., Irigoyen, M. C., & De Angelis, K. (2007). Maximal exercise test is a useful method for physical capacity and oxygen comsumption determination in streptozotocin-induced diabetic rats.
Sprague, B. L., Trentham-Dietz, A., & Cronin, K. A. (2012). A sustained decline in postmenopausal hormone use: Results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2010.
Srividhya, N. B., Singh, N., Goel, N., Gambhir, J. K., Rathi, V., & Rajaram, S. (2015). Comparison of antiresorptive effect of hormone therapy and ibandronate in postmenopausal osteoporotic women by assessing type I collagen C-telopeptide levels.
Tanaka, H., Mine, T., Ogasa, H., Taguchi, T., & Liang, C. T. (2011). Expression of RANKL/OPG during bone remodeling in vivo.
Tartibian, B., Hajizadeh Maleki, B., Kanaley, J., & Sadeghi K. (2011). Long-term aerobic exercise and omega-3 supplementation modulate osteoporosis through inflammatory mechanisms in post-menopausal women: a randomized, repeated measures study.
Tromp, A. M., Bravenboer, N., Tanck, E., Oostlander, A., Holzmann, P. J., Kostense, P. J., Roos, J. C., Burger, E. H., Huiskes, R., & Lips, P. (2006). Additional weight bearing during exercise and estrogen in the rat: the effect on bone mass, turnover, and structure.
van Geel, T. A., Geusens, P. P., Winkens, B., Sels, J. P., & Dinant, G. J. (2009). Measures of bioavailable serum testosterone and estradiol and their relationships with muscle mass, muscle strength and bone mineral density in postmenopausal women: a cross-sectional study.
Walsh, M. C., Kim, N., Kadono, Y., Rho, J., Lee, S. Y., Lorenzo, J., & Choi, Y. (2006). Osteoimmuology: interplay between the immune system and bone metabolism.
Wang, C., Wang, X., Xu, X. L., Yuan, X. L., Gou, W. L., Wang, A. Y., Guo, Q. Y., Peng, J., & Lu, S. B. (2014). Bone microstructure and regional distribution of osteoblast and osteoclast activity in the osteonecrotic femoral head.
Wang, T., Zhang, X., & Li, S. (2014). Effect of different types of jumps on the expression of IL-6, OPG and RANKL in rat tibia.
Wang, Q., Yang, M., & Wang, J. (2013). Effects of treadmill exercise on mRNA expression levels of osteoprotegerin, RANKL and RUNX2 in bone tissues of ovariectomized.
Wieczorek-Baranowska, A., Nowak, A., & Pilaczyska-Szczeniak, L. (2012). Osteocalcin and glucose metabolism in postmenopausal women subjected to aerobic training program for 8 weeks.
Xia, J., Luo, R., Guo, S., Yang, Y, Ge, S., Xu, G., & Zeng, R. (2019). Prevalence and risk factors of reduced bone mineral density in systemic lupus erythematosus patients: A meta-analysis.
Zhao, R., Zhang, M., & Zhang, Q. (2017). The effectiveness of combined exercise interventions for preventing postmenopausal bone loss: A systematic review and meta-analysis.
Zidon, T. M., Park, Y. M., Welly, R. J., Woodford, M. L., Scroggins, R. J., Britton, S. L., Koch, L. G., Booth, F. W., Padilla, J., Kanaley, J. A., & Vieira-Potter, V. J. (2018). Voluntary wheel running improves adipose tissue immunometabolism in ovariectomized low-fit rats.